膜片鉗 Patch Clamp
膜片鉗技術是一種以記錄離子通道的離子電流來反映細胞膜上單一的( 或多個的) 離子通道分子活動的技術。20世紀80 年代Neher, Sigworth 等科學家對膜片鉗進行了精心的改進，實現了單根電極既鉗制膜電位又記錄單通道電流的突破，並隨後引進了膜片遊離技術和全細胞記錄技術（Whole-cell recording），而使該技術更趨完善，具有1pA 的電流靈敏度、1μm 的空間分辨率和10μs 的時間分辨率。1983 年10 月，《Single- Channel Recording》一書的問世，奠定了膜片鉗技術的裏程碑，為細胞電生理的研究帶來了一場革命性的變化，膜片鉗技術像基因克隆技術一樣，給生命科學研究帶來了巨大的動力。Sakmann 和Neher 也因其傑出的工作和突出貢獻，榮獲1991 年諾貝爾醫學和生理學獎。
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隨著膜片鉗技術的出現，目前有幾種不同的記錄方式：
（1） 細胞吸附式（cell-attached mode）是膜片鉗的基本方式，其它方式 由此衍生。將經熱拋光的微電極與細胞膜表面形成高阻封接，這時直接對膜片進行鉗制，高分辨測量膜電流，這種方式稱為細胞貼附式。 （2） 內面向外模式( inside-out mode) 高阻封接形成後，將微電極輕輕提起，在微電極尖端逐步形成密封囊泡，並與細胞脫離，在空氣中短暫暴露幾秒鐘後，可使囊泡的外面破裂，從而形成內面向外的模式。 （3） 外面向外模式( outside-out mode) 高阻封接形成後，繼續以負壓抽吸，膜片破裂，再將微電極慢慢從細胞表面提起，膜外面自然封閉而對外，形成外面向外模式。 （4） 全細胞模式( whole-cell mode) 在細胞吸附式的基礎上，繼續以負壓抽吸或加一定的電脈沖，使電極管內細胞膜破裂，電極內液與胞內液直接相通，此方式即為全細胞模式。 |
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單細胞膜片鉗記錄系統/傳統膜片鉗配置
（1）膜片鉗放大器：
由於離子通道電流通常在pA 到nA 範圍內，為了能夠記錄到如此微弱的通道電流，就需要特殊的電路設計的放大器給予保障。隨著技術的發展，膜片鉗放大的精度和低噪聲的能力越來越強，目前國內常見的是德國HEKA 公司的EPC 10USB 系列和美國MD（Axon）公司的MultiClamp 700B、Axopatch 200B 等產品。
（2）數模/ 模數轉換器：
用於對模擬信號和數碼信號進行轉換。目前的數模/ 模數轉換器多為16 位高分辨率、多通道采集，如德國HEKA公司LIH 8+8、美國MD（Axon）公司的Digidata 1550A 等。
（3）取樣與分析軟件：
用於采集並分析通道信號。采集軟件如德國HEKA 公司的Patchmaster、Fitmaster 和美國MD（Axon）公司的pClamp 11，都是經典的膜片鉗采樣分析軟件包。
（4）微操縱器：
是用於操縱放大器的電極，調節記錄微電極的位置使之與細胞形成封接，或調節註射電極和給藥電極的位置，用於給細胞註射或者施加藥物等物質。常見的生產廠家有英國的Scientifica 公司、美國Sutter 公司、SD 公司等。
（5）顯微鏡：
單細胞膜片鉗系統所使用的是倒置顯微鏡，目前市場上用於膜片鉗實驗的倒置顯微鏡有日本的Olympus、Nikon公司以及德國的Leica 公司三大品牌，少數來自德國Zeiss 公司。如日本Olympus IX51/71/81 型、Nikon Ti-S/U 型、Leica DMI3000 型。
（6）微電極拉制儀：
用於制備各種玻璃微電極，有很多種類型。常見的有兩種：一種為垂直型微電極拉制儀，利用金屬絲（鎢絲或鉑絲）通過大電流將玻璃電極加熱到熔點，通過重力拉斷。另一種是水平程控微電極拉制儀，采用微電腦控制，可設定拉力大小、拉制的時間、拉制的方式等參數。單步或多步拉制，拉制的電極形狀多種多樣，適合於所有電生理實驗。常見的微電極拉制儀有美國Sutter 公司的P-97、P-1000，德國HEKA 公司的PIP6、日本Narishige 公司的PC-10。
（7）微電極拋光儀：
微電極拉制儀拉制出的電極，其尖端往往不是很光滑。為了能與細胞膜間形成穩定可靠的封接，一般拉制出的微電極需要進行拋光處理（全細胞記錄有時可不需要拋光，單通道記錄最好拋光！），此時需要使用拋光儀。在單通道實驗中還需要在微電極尖端塗上疏水矽膠樹脂（Sylgard）以減小跨壁電容（Trans- mural capacitance）帶來的噪聲。常見的有美國Warner 公司的MFG-5 型、日本Narishige 公司的MF-830 型。
（8）給藥系統：
研究離子通道時候，觀察藥物的作用是基本的實驗方法，根據實驗目的和實驗標本的不同選用合適的給藥系統非常重要。常見的廠家有美國Warner 公司、ALA 公司。如美國Warner 公司的PLI-100 壓力噴射給藥系統，美國ALA公司的VC3-4/8PG 型4/8 道灌流系統等。
（9）細胞記錄槽系統：
細胞或腦片/ 組織片灌流槽是放置標本的浴槽，根據標本以及實驗目的不同其型號也不同，RC 系列細胞記錄槽類型多樣，滿足各種實驗要求，是美國Warner 公司產品，較為常用。
（10）溫度控制儀：
在膜片鉗實驗中，常常需要將細胞或腦片/ 組織片保持在一個相對恒溫系統中，以保持標本活性，這就需要有恒溫控制儀。常見的有美國Warner 公司的TC-324C、TC344C 以及美國Dagan 公司的PID-10、HCC-100A 等。
（11）蠕動泵：
用於向標本持續輸送營養液，以維持標本的生物活性。其種類繁多，國產進口均有。國外的如美國Harvard 公司的各種蠕動泵，國產的如河北蘭格公司各種類型。
（12）防震台與屏蔽網：
膜片鉗實驗中，細胞膜和記錄電極尖端封接後，震動極易使封接斷開，從而導致實驗失敗。所以，整個實驗使用防震台來減小震動顯得非常重要。同時，靜電屏蔽網是防止雜電場（如日光燈、電腦等）對膜片鉗放大器探頭電路產生干擾的重要手段。美國TMC 公司的TMC63-500 系列是性能優良的防震台，適用於膜片鉗、細胞註射、光學、激光共聚焦顯微鏡等各種需要防震的實驗中。屏蔽網一般采用國產。
（13）顯微鏡擴展平台：
放置在顯微鏡載物台兩側，用於固定微操縱器。廠家有美國Sutter 公司、日本Narishige 公司，國內有HongKong Plexon 公司等。
（14）儀器架：
用於放置膜片鉗以及其他電生理實驗的各種實驗儀器，如放大器，示波器等，目前的儀器架的設計非常靈活，可方便移動、拆卸與安裝。並可根據實驗者的要求進行定制。
由於離子通道電流通常在pA 到nA 範圍內，為了能夠記錄到如此微弱的通道電流，就需要特殊的電路設計的放大器給予保障。隨著技術的發展，膜片鉗放大的精度和低噪聲的能力越來越強，目前國內常見的是德國HEKA 公司的EPC 10USB 系列和美國MD（Axon）公司的MultiClamp 700B、Axopatch 200B 等產品。
（2）數模/ 模數轉換器：
用於對模擬信號和數碼信號進行轉換。目前的數模/ 模數轉換器多為16 位高分辨率、多通道采集，如德國HEKA公司LIH 8+8、美國MD（Axon）公司的Digidata 1550A 等。
（3）取樣與分析軟件：
用於采集並分析通道信號。采集軟件如德國HEKA 公司的Patchmaster、Fitmaster 和美國MD（Axon）公司的pClamp 11，都是經典的膜片鉗采樣分析軟件包。
（4）微操縱器：
是用於操縱放大器的電極，調節記錄微電極的位置使之與細胞形成封接，或調節註射電極和給藥電極的位置，用於給細胞註射或者施加藥物等物質。常見的生產廠家有英國的Scientifica 公司、美國Sutter 公司、SD 公司等。
（5）顯微鏡：
單細胞膜片鉗系統所使用的是倒置顯微鏡，目前市場上用於膜片鉗實驗的倒置顯微鏡有日本的Olympus、Nikon公司以及德國的Leica 公司三大品牌，少數來自德國Zeiss 公司。如日本Olympus IX51/71/81 型、Nikon Ti-S/U 型、Leica DMI3000 型。
（6）微電極拉制儀：
用於制備各種玻璃微電極，有很多種類型。常見的有兩種：一種為垂直型微電極拉制儀，利用金屬絲（鎢絲或鉑絲）通過大電流將玻璃電極加熱到熔點，通過重力拉斷。另一種是水平程控微電極拉制儀，采用微電腦控制，可設定拉力大小、拉制的時間、拉制的方式等參數。單步或多步拉制，拉制的電極形狀多種多樣，適合於所有電生理實驗。常見的微電極拉制儀有美國Sutter 公司的P-97、P-1000，德國HEKA 公司的PIP6、日本Narishige 公司的PC-10。
（7）微電極拋光儀：
微電極拉制儀拉制出的電極，其尖端往往不是很光滑。為了能與細胞膜間形成穩定可靠的封接，一般拉制出的微電極需要進行拋光處理（全細胞記錄有時可不需要拋光，單通道記錄最好拋光！），此時需要使用拋光儀。在單通道實驗中還需要在微電極尖端塗上疏水矽膠樹脂（Sylgard）以減小跨壁電容（Trans- mural capacitance）帶來的噪聲。常見的有美國Warner 公司的MFG-5 型、日本Narishige 公司的MF-830 型。
（8）給藥系統：
研究離子通道時候，觀察藥物的作用是基本的實驗方法，根據實驗目的和實驗標本的不同選用合適的給藥系統非常重要。常見的廠家有美國Warner 公司、ALA 公司。如美國Warner 公司的PLI-100 壓力噴射給藥系統，美國ALA公司的VC3-4/8PG 型4/8 道灌流系統等。
（9）細胞記錄槽系統：
細胞或腦片/ 組織片灌流槽是放置標本的浴槽，根據標本以及實驗目的不同其型號也不同，RC 系列細胞記錄槽類型多樣，滿足各種實驗要求，是美國Warner 公司產品，較為常用。
（10）溫度控制儀：
在膜片鉗實驗中，常常需要將細胞或腦片/ 組織片保持在一個相對恒溫系統中，以保持標本活性，這就需要有恒溫控制儀。常見的有美國Warner 公司的TC-324C、TC344C 以及美國Dagan 公司的PID-10、HCC-100A 等。
（11）蠕動泵：
用於向標本持續輸送營養液，以維持標本的生物活性。其種類繁多，國產進口均有。國外的如美國Harvard 公司的各種蠕動泵，國產的如河北蘭格公司各種類型。
（12）防震台與屏蔽網：
膜片鉗實驗中，細胞膜和記錄電極尖端封接後，震動極易使封接斷開，從而導致實驗失敗。所以，整個實驗使用防震台來減小震動顯得非常重要。同時，靜電屏蔽網是防止雜電場（如日光燈、電腦等）對膜片鉗放大器探頭電路產生干擾的重要手段。美國TMC 公司的TMC63-500 系列是性能優良的防震台，適用於膜片鉗、細胞註射、光學、激光共聚焦顯微鏡等各種需要防震的實驗中。屏蔽網一般采用國產。
（13）顯微鏡擴展平台：
放置在顯微鏡載物台兩側，用於固定微操縱器。廠家有美國Sutter 公司、日本Narishige 公司，國內有HongKong Plexon 公司等。
（14）儀器架：
用於放置膜片鉗以及其他電生理實驗的各種實驗儀器，如放大器，示波器等，目前的儀器架的設計非常靈活，可方便移動、拆卸與安裝。並可根據實驗者的要求進行定制。
腦片/ 組織片膜片鉗記錄系統
在一般單細胞記錄系統的基礎上，增加腦片/ 組織片制備和刺激隔離系統、更換一些配置就構成腦片/ 組織片膜
片鉗記錄系統：
（1）正置顯微鏡：
在腦片/ 組織片膜片鉗記錄系統采用正置顯微鏡，高倍物鏡為浸水鏡頭，且為了滿足可視效果，腦片/ 組織片膜片鉗記錄系統還需要紅外線裝置。日本Olympus 的BX53 型、Nikon 公司的FN-1 型、德國Leica 公司的DM6000FS型等較為常見。英國Scientifica 公司的SliceScope 型號顯微鏡以獨特鏡身設計，可輕松升級到在體膜片鉗顯微鏡或者在體雙光子顯微鏡模式。
（2）顯微鏡X-Y 移動平台：
用顯微鏡X-Y 移動平台與支撐平台替換顯微鏡擴展平台，便於實驗標本的操作。生產廠家有英國Scientifica 公司和美國Sutter 公司。
（3）腦片/ 組織片切片機：
在腦片/ 組織片的膜片鉗實驗中，常需要將腦/ 組織切成100-400μm 左右的薄片，腦片/ 組織片切片機就是用於制備高活性腦片/ 組織片的設備。目前震動切片機最流行，常見的有英國Campden 公司的5000mz 和7000smz 型，德國Leica 公司的VT 系列切片機。
（4）刺激隔離系統：
用於對組織施加細胞外刺激，如進行突觸前單或串刺激誘發長時程增強（LTP）或長時程抑制（LTD）以及其他場電位的誘發，包括刺激器與隔離器（一般選擇與刺激器配套的隔離器）。主要產品有美國Plexon 公司的plexstim2.0 型、美國A-M System 公司的Model 2100 型、以色列AMPI 公司的Master 系列等多通道刺激器。
在一般單細胞記錄系統的基礎上，增加腦片/ 組織片制備和刺激隔離系統、更換一些配置就構成腦片/ 組織片膜
片鉗記錄系統：
（1）正置顯微鏡：
在腦片/ 組織片膜片鉗記錄系統采用正置顯微鏡，高倍物鏡為浸水鏡頭，且為了滿足可視效果，腦片/ 組織片膜片鉗記錄系統還需要紅外線裝置。日本Olympus 的BX53 型、Nikon 公司的FN-1 型、德國Leica 公司的DM6000FS型等較為常見。英國Scientifica 公司的SliceScope 型號顯微鏡以獨特鏡身設計，可輕松升級到在體膜片鉗顯微鏡或者在體雙光子顯微鏡模式。
（2）顯微鏡X-Y 移動平台：
用顯微鏡X-Y 移動平台與支撐平台替換顯微鏡擴展平台，便於實驗標本的操作。生產廠家有英國Scientifica 公司和美國Sutter 公司。
（3）腦片/ 組織片切片機：
在腦片/ 組織片的膜片鉗實驗中，常需要將腦/ 組織切成100-400μm 左右的薄片，腦片/ 組織片切片機就是用於制備高活性腦片/ 組織片的設備。目前震動切片機最流行，常見的有英國Campden 公司的5000mz 和7000smz 型，德國Leica 公司的VT 系列切片機。
（4）刺激隔離系統：
用於對組織施加細胞外刺激，如進行突觸前單或串刺激誘發長時程增強（LTP）或長時程抑制（LTD）以及其他場電位的誘發，包括刺激器與隔離器（一般選擇與刺激器配套的隔離器）。主要產品有美國Plexon 公司的plexstim2.0 型、美國A-M System 公司的Model 2100 型、以色列AMPI 公司的Master 系列等多通道刺激器。
德國HEKA-放大器
EPC10 USB Single 單通道放大器
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EPC10 USB Double 雙通道放大器
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EPC10 USB Triple 三通道放大器
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EPC10 USB Quadro 四通道放大器
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德國HEKA-分析軟體
PATCHMASTER 電生理紀錄分析軟體
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POTMASTER 電化學紀錄分析軟體
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FITMASTER 分析軟體
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